你输入基因名，系统帮你做什么
PrimerCat 包含三个独立工具：qPCR 引物设计、CRISPR gRNA 设计、BLAST 序列比对。每个工具的工作方式都透明可查，结果页会把推理依据一起带回来。
输入基因名称，系统自动在 NCBI 数据库里找到最合适的参考序列——不需要你自己去下载或粘贴。
不只给你一条引物或 gRNA 序列，还告诉你它为什么排在前面：Tm、GC 含量、特异性状态、跨外显子设计……每一项都列在结果页里。
筛查范围和边界会在结果里明确标注，不让你去猜「这个结果能信多少」。
qPCR 通过荧光染料或探针，在每个 PCR 循环实时监测扩增产物的积累量。荧光信号超过背景阈值时的循环数称为 Ct 值——Ct 越小，起始模板量越多。这使得 qPCR 成为检测基因表达量（mRNA 水平）的标准方法。
检测基因表达时，先用逆转录酶将 mRNA 反转录为 cDNA（互补 DNA），再以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增，称为 RT-qPCR。这是目前最常用的基因表达定量方法。基因组 DNA 污染是 RT-qPCR 常见干扰源，跨外显子引物设计可有效排除该干扰。
熔解温度（Tm）是引物与模板恰好半解链时的温度，决定了 PCR 最佳退火温度。G-C 碱基对（3 个氢键）比 A-T（2 个氢键）更稳定，GC 含量越高，Tm 越高。理想引物 Tm 在 58–62°C、GC% 在 40–60%，既保证与模板高效结合，也减少非特异性扩增。
基因组 DNA 含有内含子，而成熟 mRNA 经剪接已将内含子去除。将引物设计在两个相邻外显子的交界处，扩增子仅存在于 cDNA 中，而不存在于基因组 DNA——从而避免基因组 DNA 残留导致的假阳性扩增。
引物自身折叠形成的发卡结构（hairpin）会阻碍其与模板结合；两条引物相互配对形成的二聚体会竞争消耗引物，降低扩增效率。PrimerCat 通过 Primer3 的热力学模型在设计阶段筛除这类结构风险高的候选引物。
guide RNA（gRNA，约 20 nt）通过碱基互补配对定位到基因组目标位点，引导 Cas9 核酸酶在 PAM 位点上游 3 bp 处切割双链 DNA。细胞修复时发生非同源末端连接（NHEJ，产生插入/缺失突变，用于基因敲除）或同源定向修复（HDR，用于精准替换）。
PAM（原型间隔子邻近基序）是紧邻 gRNA 靶序列的短核苷酸序列，是 Cas 蛋白识别并结合 DNA 的必要条件。SpCas9 需要 NGG，SpCas9-NG 放宽为 NG，Cas12a 识别靶序列 5' 端的 TTTV。PAM 位点密度决定了给定序列可设计的 gRNA 数量上限。
NCBI RefSeq 数据库收录了经审校的基因参考转录本（NM_ 编号）和蛋白序列（NP_ 编号）。同一基因往往有多个转录本（剪接异构体）。PrimerCat 优先选取 CDS 最完整、外显子最多的主转录本作为设计模板，并在结果页注明所选转录本 ID 及选择依据。
qPCR 引物设计
输入基因名称，系统自动完成模板查找、引物生成、特异性初筛、综合排序，最后把推荐理由和设计依据一起展示给你。
系统从 NCBI RefSeq 数据库实时查询，筛选编码蛋白质的转录本，优先选 CDS 最完整、外显子最多的主要转录本作为设计模板。
基于转录本序列，在 Tm、GC%、产物长度、发卡结构和二聚体风险的约束下批量生成引物，初步按评分过滤。
所有候选引物一次性提交到本地 Bowtie2，直接与参考基因组（hg38/mm10）比对，过滤掉在基因组其他位置有高度相似命中的候选。无需 NCBI 网络连接，全程在服务器本地完成。
引物按 Tm、GC%、基因组特异性状态、跨外显子能力、二聚体风险五个维度综合排序。结果页同时展示每对引物的推荐理由和扩增子信息。
特异性筛查在基因组层面完成（本地 Bowtie2 比对 hg38/mm10），覆盖全部基因组位置，但不等同于实验室 PCR 验证。内含子区的命中会被保守标记——对以 cDNA 为模板的 RT-qPCR 影响有限，建议结合实际实验结果综合判断。
CRISPR gRNA 设计
输入基因名称或直接粘贴序列，系统扫描全部 PAM 位点、按活性打分排序，并对每条 gRNA 做本地基因组层面脱靶风险筛查。
输入基因名称，系统自动从 NCBI RefSeq 获取编码序列。也可以直接粘贴任意 DNA 序列，灵活适配不同场景。
在正链和互补链上扫描全部 PAM 位点，支持 SpCas9（NGG）、SpCas9-NG（NG）、Cas12a（TTTV）三种核酸酶。
基于 GC 含量、种子区序列特征、3' 末端偏好等序列特征对每条 gRNA 打分，按预测活性排序，把最有潜力的候选排在前面。
每条 gRNA 经本地 Bowtie2 与参考基因组（hg38/mm10）比对，允许最多 3 个错配，结果标注为低/中/高风险，并显示最高相似性命中和具体比对信息。全程在服务器本地完成，无需 NCBI 网络连接。
活性分数基于序列特征估算，不是经实验验证的预测值。脱靶筛查是初步过滤（基因组层面，≤3 错配），正式 CRISPR 实验前建议进行更严格的全基因组脱靶分析和湿实验验证。
有经验的科研用户对「保证准确」类措辞天然保持警惕。PrimerCat 的做法是：把每一步的依据和局限直接写在结果页，由用户自己判断是否足够。